Als Kind wollte sie eigentlich entweder Ärztin oder Meeresbiologin werden, in der High School jedoch, in der sie später ihre ersten Rollen spielte, wuchs ihr Interesse an der Schauspielerei. Im Teenageralter wurde sie von einer Modelagentur entdeckt und begann eine Modelkarriere, die sie unter anderem nach Frankreich, Japan, Italien, Griechenland und Deutschland führte. Sie schloss die High School im Jahr 2000 mit der Auszeichnung "der am meist geachteten Person" ab, arbeitete weiter als Fotomodell bis sie sich in Los Angeles niederließ, um eine Schauspielkarriere zu starten.

Ihr erster Auftritt war eine Gastrolle in der vom US-Sender Showtime produzierten Sendung Jeremiah. Seitdem hatte sie Auftritte in einigen US-Serien, wie zum Beispiel einer wiederkehrenden Rolle in The L Word. Ihre erste permanente Beschäftigung in einer Serie war die Rolle der Juliet Droil in der ABC-Serie Veritas: The Quest. Es gab allerdings nur 13 Folgen dieser Sendung.

Aktuell spielt sie eine der Hauptrollen in der US-Comedyserie How I Met Your Mother, in der sie unter anderem an der Seite von Alyson Hannigan und Neil Patrick Harris die kanadische Fernsehreporterin Robin Scherbatsky mimt. Laut der Zeitschrift TV Guide erwartet Smulders im Frühjahr 2009 ihr erstes Kind. Vater ist der Schauspieler Taran Killam.